萤光素酶报告基因检测系统由于其特异性高、灵敏度强、操作简便等优点，在基因表达调控、蛋白质相互作用、信号通路等研究领域具有广泛应用。

而双萤光素酶报告基因检测系统，则是在单萤光素酶报告基因的基础上，引入了“内参对照”报告基因，可以排除不同组之间细胞生长状况、细胞数目以及转染效率等带来的干扰，使实验结果更为可靠。

那么，双萤光素酶报告基因与单萤光素酶报告基因检测系统在操作上有何不同？该如何进行检测？别急，今天小编就带你一探究竟，让你轻松掌握这个报告基因检测的“神器”！

01 检测原理

双萤光素酶报告基因检测系统含有两种萤光素酶——萤火虫萤光素酶（Firefly Luciferase）和海肾萤光素酶（Renilla Luciferase），萤火虫荧光素酶作为报告基因，催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物萤光；海肾荧光素酶作为内参基因，催化coelenterazine 氧化成coelenteramide，在coelenterazine 氧化的过程中，同样也会发出生物萤光。通过酶标仪等测定反应过程中释放的生物萤光，计算出两种荧光读值的比值，即可比较各组间萤光素酶活性差异，从而判断基因表达情况。

02 检测应用

microRNA研究：在报告基因的3'端加上目的基因的3'UTR，用来检测miRNA对于目的基因的调控（抑制作用），报告基因表达越少，说明miRNA的作用就越强。

转录调控研究：在报告基因的5'端加上待检测基因的启动子，用来检测转录因子对启动子的作用，启动转录越多，那报告基因的表达量就越大，荧光值越高。

启动子研究：将启动子区域序列进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建到luciferase报告载体中，检测其启动子活性。

信号通路研究：信号通路的激活/监测基因的表达水平。

03 操作流程

质粒构建：双萤光素酶报告基因系统一般将萤火虫萤光素酶报告基因质粒和海肾萤光素酶报告基因质粒共转染细胞，或将这两个报告基因构建到同一个骨架质粒上（如pGL4质粒），分别用不同的启动子启动其表达。

细胞转染：转染方法选择根据实验目的选择瞬时转染和稳定转染。对于短期表达的目的基因产物，可以选用瞬时转染法，操作更为简便。对于需要长期稳定表达目的基因产物，建议选用稳定转染法，稳定性更好。主报告基因：内参报告基因转染比例通常为10:1-100:1，启动子和转录因子比例启动子和转录因子比例一般为1:9。

04 报告基因检测

检测仪器：发光检测仪（Luminometer），或带有发光检测模块的多功能酶标仪。

发光模式：化学发光（Luminescence）。

检测类别：终点法检测。

波长范围：无需设置波长，如需选择，推荐全波长380-780 nm。注：只选择在最大波长处检测发光，过滤掉其他发光信号，意味着检测会丢掉部分信号，损失灵敏度。

读取模式：底读或顶读。

数据分析：通过酶标仪等仪器读出萤火虫和海肾萤光素酶的数值，两种荧光值读数不少于4位数，读数大于8位数时，需要稀释裂解上清（读数与细胞种类、细胞状态、转染方法、转染时间等因素相关）。

相对表达倍数具体计算公式：归一化值=萤火虫萤光素酶读值（主报告基因）/海肾萤光素酶读值（内参基因）相对表达倍数=实验组归一化值/对照组归一化值

怎么样，看到这里大家有没有掌握双萤光素酶报告基因检测的思路和方法呢？如果你还有其他问题，欢迎在评论区留言，和大家一起探讨！

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